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       以細胞融合為基礎(chǔ)的鼠雜交瘤技術(shù)的發(fā)展，使得人們能夠大量獲取高親和性和強特異性的鼠單克隆抗體(McAb)， McAb 在理論和實踐上的應(yīng)用成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等許多重大問題的重要手段。但是鼠源性單抗應(yīng)用于人類的臨床應(yīng)用結(jié)果反映出了單克隆抗體藥物存在的一些問題 :
       鼠源性單抗容易容易產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA) ,在體內(nèi)作為異源蛋白被清除掉，從而削弱其治療的有效性。鼠源性單抗在人體內(nèi)生物活性降低，其 Fc 段不能有效激活人體 FcRn 及補體系統(tǒng)的效應(yīng)功能。
       鼠源性單抗在人體內(nèi)的半衰期短，因而降低了其療效。
       因此，人們一直致力于人源性抗體的研究，鼠抗體人源化就是通過基因改造，使其和人體內(nèi)的抗體分子具有極其相      似的輪廓，從而逃避人免疫系統(tǒng)的識別，避免誘導(dǎo) HAMA（人抗鼠抗體）反應(yīng)。進行抗體的人源化有兩個基本原則：保持或提高抗體的親和力和特異性；大大降低或基本消除抗體的免疫原性。人源化有多種方案，都必須遵循這      兩個原則，尤其不能喪失抗體特異結(jié)合的能力。

鼠源性單抗
       人用鼠源單抗的生產(chǎn)方法一般分為體內(nèi)法和體外法 2 種。
       體內(nèi)法：體內(nèi)法即腹水法。盡管腹水中抗體濃度比較高(2-10mg/ml)，但由于所用的 BALB/c 小鼠必須達到 SPF 級， 繁殖、飼養(yǎng) BALB/c 小鼠及生產(chǎn)腹水、純化抗體的廠房必須符合 GMP 要求，WHO 及我國對體內(nèi)法生產(chǎn)的人用鼠源單克隆抗體的質(zhì)檢項目繁多，要求嚴格，因此限制了體內(nèi)法在人用鼠源單抗生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用。
       體外法：體外法(雜交瘤細胞體外培養(yǎng)法)的產(chǎn)品純度高，可以避免鼠類病毒的污染，簡化質(zhì)檢項目，操作具有可控制性，適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，因此是人用鼠源單抗生產(chǎn)方式的主要發(fā)展方向。體外法的制備流程也基本相同，即從超免疫的供體中即抗原免疫的小鼠獲取脾細胞，選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞，待細胞融合后，      對單個細胞進行克隆，體外培養(yǎng)出能分泌單抗的克隆細胞。

人鼠嵌合性單抗（Chimeric Antibody）

第一代人源化抗體是將鼠 McAb 的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)組成嵌合抗體。由于異源性 Ab 的免疫反應(yīng)約有 90%是針對恒定區(qū)（C 區(qū)），要降低 mAb 的抗原性，必須對Ab 的恒定區(qū)進行人源化。構(gòu)建嵌合抗體的大致原理是，從分泌某 mAb 的雜交瘤細胞基因組中分離和鑒別出重排的功能性可變區(qū)（V 區(qū)）基因，經(jīng)基因重組與 Ig 恒定區(qū)基因相拼接，插入到適宜的表達載體中，構(gòu)成鼠/人嵌合的輕重鏈基因表達質(zhì)粒， 經(jīng)轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞，通過篩選即可制備出鼠/人嵌合抗體。這種嵌合抗體同鼠源抗體
比較至少有以下兩個優(yōu)點：

• 它可以按需要對抗體的效應(yīng)基因進行選擇或剪切。例如人 Ig 的同種型 IgG1 和 IgG3 對介導(dǎo)補體依賴及細胞介導(dǎo)的溶解作用具備優(yōu)勢，因而利用該技術(shù)可以拼接不同亞類的人 C 區(qū)基因，來改變抗體的效應(yīng)功能， 使原細胞毒性較低的 IgG2a 和 IgG2b 變成細胞毒性較高的 IgG1 和 IgG3，增強抗體的免疫治療功能，可用來殺死腫瘤細胞。

• 在治療中使用人而不是鼠 mAb 的同種型，減小了鼠源 mAb 作為異種蛋白對人體的免疫原性，它通過避免抗同種型抗體的產(chǎn)生，減少了 HAMA 的生成。例如，當鼠對鼠Ig 互補決定區(qū)（CDR）產(chǎn)生免疫耐受時， 用鼠抗-淋巴細胞 Ab 可以激發(fā)抗獨特型反應(yīng)，但相對那些對可變區(qū)不耐受的動物來說，該鼠的抗獨特型反應(yīng)被推遲并很微弱。

迄今已研制出很多鼠/人嵌合抗體，有些已陸續(xù)進入臨床應(yīng)用，主要用于惡性腫瘤的診療，它在預(yù)防移植排     斥反應(yīng)也取得了較為滿意的效果，在治療自身免疫疾病以及控制藥物過量、藥物過敏反應(yīng)中已顯示出巨大優(yōu)勢。但是因為有鼠 McAb 可變區(qū)的存在，應(yīng)用時仍會引起較強烈的 HAMA 反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，進一步將鼠 McAb 可變區(qū)中相對保守的 FR 換成人的 FR，僅僅保留抗原結(jié)合部位 CDR(即 CDR 移植)—即把鼠抗體的 CDR 序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱 CDR 移植抗體或改型抗體，也就是真正意義上的人源化抗體。

CDR 移植單抗（CDR Grafting Monoclonal Antibody）
完全 CDR 移植抗體（改型抗體）
完全 CDR 移植抗體由于鼠源性抗體 VR 中的骨架區(qū)仍殘留一定的免疫原性，為最大限度的減少鼠源成分，用人 FR 替代鼠 FR 可形成更為完全的人源化抗體，即在此抗體中除了３個 CDR 是鼠源以外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)，這一類型的抗體稱為 CDR 移植抗體或改型抗體。CDR 移植抗體中非人序列含量低（約 5%），研究已證實其免疫原性大大減小，并且在人體內(nèi)的血清半衰期延長。
CDR 移植技術(shù)的理論依據(jù)是：

• CDR 是決定抗原結(jié)合位點的唯一結(jié)構(gòu)，因而也是抗體特異性和親和力的決定部位。

• 框架區(qū)能夠接受外源 CDR 的植入。CDR 移植不僅可以降低 mAb 的免疫原性，而且還可以把鼠源 mAb 與Ag 結(jié)合的性質(zhì)授予人抗體。
  應(yīng)用這一策略，將鼠源 McAb 的 CDR 區(qū)完全移植，得到了抗磷脂酰肌醇（蛋白）聚糖嵌合抗體。但隨后多項研究發(fā)現(xiàn)，簡單的 CDR 移植往往明顯降低抗原－抗體反應(yīng)的親和力，甚至喪失與抗原結(jié)合的能力。其原因在于 FR 不僅作為骨架對 CDR 起到支持作用，F(xiàn)R 中的某些非 CDR 區(qū)補充調(diào)控殘基還為 CDR 的回折構(gòu)象提供必要的支持，其形狀和側(cè)鏈大小協(xié)同決定 CDR 的基本結(jié)構(gòu)，影響 CDR 與抗原結(jié)合的特異性和親和力。

部分 CDR 移植抗體
在簡單 CDR 移植的基礎(chǔ)上又相繼發(fā)展了部分 CDR 移植技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)輕鏈的 CDR1、CDR2 和重鏈的 CDR3 對保證抗體與抗原特異性結(jié)合至關(guān)重要，其余三個 CDR 的作用則較低。因此只將抗體結(jié)合抗原必須的 CDR 移植到人抗體的 FR 骨架上即能獲得對人免疫原性更小的嵌合抗體，這類抗體稱為部分 CDR 移植抗體。目前，對 CDR 移植的人源化路線是，在鼠/人嵌合抗體的基礎(chǔ)上，通過數(shù)據(jù)庫檢索、計算機分子模擬等尋找出有最大同源性的人可變區(qū)模板，綜合考慮表面殘基、與 CDR 有相互作用或?qū)臻g結(jié)構(gòu)有重要影響的殘基，確定需要保留和改變的關(guān)鍵殘基，再通過模擬基因合成，表達檢測實際效果，進行必要的修正，來獲得高親和力的治療 mAb。目前已構(gòu)建出多種針對不同抗原的 CDR 移植抗體，有些已應(yīng)用于臨床診治，并取得了令人滿意的效果，如消除腫瘤，延長器官移植生存期，改善類風濕關(guān)節(jié)炎、全身性脈管炎、感染性疾病及免疫混亂性疾病的臨床癥狀等。

表面重塑抗體
然而，只通過移植 CDR 序列產(chǎn)生的人化抗體與抗原結(jié)合的能力遠不及其親代鼠源 Mab。為了恢復(fù)其高親和力，必須對 mAb 進行進一步的分析、設(shè)計、改建工作，使其抗原決定環(huán)的結(jié)構(gòu)更加完善。Chothia 和 LesK 首先提出一些框架殘基對 CDR 構(gòu)象因此的重要性，并綜合地檢測了所有影響抗原結(jié)合的框架殘基。Xiang 等發(fā)現(xiàn)嵌合抗體B72.3 的 71 和 93 框架殘基是重鏈超變環(huán)構(gòu)象的主要決定部分。因此，可用親代鼠源抗體的相關(guān)序列替代 CDR 移植抗體 V 區(qū)框架區(qū)的關(guān)鍵殘基，使 CDR 構(gòu)象得以維持。但這同時又增加了鼠源序列的成分，致使免疫原性也加強。從治療的角度考慮，最好是能夠找到框架區(qū)變化最小而抗原親和力又很高的人化抗體。盡管有分子模擬法的指導(dǎo)， 但要測定哪些框架變化對抗原結(jié)合有益，通常需要分析許多不同的抗體突變型。
該策略作為較新的一種人源化途徑,還在逐步成熟階段。鼠源 McAb 在人體引起的 HAMA 反應(yīng),究竟是完全由其表面的暴露殘基引起，還是由表面殘基與內(nèi)部殘基的共同貢獻，涉及到抗體產(chǎn)生最基本的免疫學(xué)機制，而這種機制仍      是目前探討的熱點。盡管有人認為，即使在 MHC 背景下鼠源 McAb 被加工和提呈后包埋殘基暴露出抗原性，但誘生的抗抗體也只能和降解的或解折疊的原抗體起反應(yīng)，不會干擾原抗體的治療效應(yīng)。

全人源化單抗（Fully Human Monoclonal Antibody）
人源化 mAb 基本上解決了鼠抗體的最重要問題——免疫原性，但是人源化過程仍很繁復(fù)且費用昂貴，它需要廣泛的計算機模型設(shè)計，即使如此，大量反復(fù)試驗仍不可避免，因為要試驗各種氨基酸置換以測定對目標選擇性和結(jié)合      親和力的有害作用。而全人源化單克隆抗體是指將人類抗體基因通過轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類編碼抗體的基      因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達人類抗體，達到抗體完全人源化的目的。
目前生產(chǎn)完全人源化抗體的方法主要包括抗體庫技術(shù)和人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)兩種。

抗體庫技術(shù)
抗體庫技術(shù)包括噬菌體抗體庫技術(shù)和核糖體展示技術(shù)。

噬菌體抗體庫技術(shù)：是利用噬菌體表達外源基因的一項新技術(shù)，是將抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL） 基因與噬菌體的外殼蛋白Ⅲ（PⅢ）或外殼蛋白Ⅷ（PⅧ）基因隨機重組，繼而感染大腸桿菌，后經(jīng)增殖并在噬菌體表面以抗體片段 Fab 或單鏈抗體可變區(qū)（ScFv）一外殼蛋白的融合蛋白形式表達。這種噬菌體顆?？梢蕴禺愖R別抗原，又能感染宿主菌進行再擴增，經(jīng)過“吸附一洗脫一擴增”過程，就能篩選并富集特異性抗體。所構(gòu)建的抗體庫稱為全套抗體庫，從中篩選到的抗體稱為噬菌體抗體。其最大特點是實現(xiàn)了直接將基因型和表型聯(lián)系在一起，可以快速而高效地從大量克隆中篩選出表達特異性的抗體。

核糖體展示技術(shù)：將基因型和表型聯(lián)系在一起，編碼蛋白的 DNA 在體外進行轉(zhuǎn)錄與翻譯，由于對 DNA 進行了特殊的加工與修飾，如去掉 3′ 末端終止密碼子，核糖體翻譯到 mRNA 末端時，由于缺乏終止密碼子， 停留在 mRNA 的 3′末端不脫離，從 而形成蛋白質(zhì)-核糖-2mRNA 三聚體，將目標蛋白特異性的配基固相化，如：固定在 ELISA 微孔或磁珠表面，含有目標蛋白的核糖體三聚體就可在 ELISA 板孔中或磁珠上被篩選
出，對篩選分離得到的復(fù)合物進行分解，釋放出的 mRNA 進行逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(yīng)(RT-PCR)，PCR 產(chǎn)物進入下一輪循環(huán)，經(jīng)過多次循環(huán)，最終可使目標蛋白和其編碼的基因序列得到富集和分離。

人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)（Transgenic Mouse）
轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人源抗體，要求人的抗體基因片段在小鼠體內(nèi)必須進行較為有效的重排與表達，并且這些片段能      與小鼠細胞的免疫系統(tǒng)信號機制相互作用，使得小鼠在受抗原刺激后，這些人抗基因片段能被選擇，表達并活化 B 細胞分泌人抗體。其基本方法是采用在鼠胚胎干細胞（ES）中的同源重組來使得鼠原有基因缺失，再通過顯微注射      等技術(shù)將重建的人源抗體胚系基因微位點轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，最終由 mAb 的雜交瘤分泌出全人序列的抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人源抗體技術(shù)是現(xiàn)在全人源抗體制研究的主流，截至 2013 年，已有 5 個由轉(zhuǎn)基因小鼠制備而來的全人源抗體被批準上市，20 余個正處在臨床試驗中。目前主要的轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人源抗體技術(shù)有HuMAb-Mouse、Xeno Mouse、VelocImmuneTM 三種方法。
相關(guān)文章：全人源化單克隆抗體制備技術(shù)（轉(zhuǎn)基因小鼠）

HuMAb-Mouse： HUMab 轉(zhuǎn)基因小鼠整合入人抗體基因 450kb(200kb Ig H；230kb Igk，約占人類 Ig Gκ的50％)，免疫該小鼠可以產(chǎn)生 0.1-5nmol／L 的抗體。雖然該小鼠轉(zhuǎn)入的人抗體基因組還是比較小，但仍獲得巨大成功。
Xeno Mouse： Xeno Mouse 轉(zhuǎn)基因小鼠也是目前最為成功、應(yīng)用最廣的轉(zhuǎn)基因小鼠之一。該轉(zhuǎn)基因小鼠整合入大部分人抗體 VH 和 Vκ基因，大小分別為 1020kb 和 800kb。重鏈包含 34 個 V 區(qū)基因、所有的重鏈 D 區(qū)和 J 區(qū)， 以及 Cγ2、Cμ和 Cδ基因，共 66 個功能基因；輕鏈包含 18 個 V 區(qū)基因、所有的 5 個 J 區(qū)和 Cκ基因，共 32 個功能基因。該轉(zhuǎn)基因小鼠 XMG2-KL 可以產(chǎn)生全人 IgM 和 IgG2，親和力可以達 0.1～1nmol／L。

VelocImmuneTM：不同于以往的轉(zhuǎn)基因小鼠抗體篩選平臺，VelocImmuneTM     產(chǎn)生人可變區(qū)與鼠恒定區(qū)組成的反向嵌合抗體。小鼠 Ig H 恒定區(qū)通過 B 細胞胞質(zhì)區(qū)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域(如 Igα與 Igβ)傳遞天然的免疫信號，并通過與其他類型免疫細胞上的 Fc 受體的結(jié)合促使小鼠產(chǎn)生強大的免疫反應(yīng)，并提供半衰期長且親和力高的抗體。該類轉(zhuǎn)基因小鼠免疫后產(chǎn)生的抗體可變區(qū)編碼序列通過基因克隆技術(shù)與人源恒定區(qū)編碼序列進行構(gòu)建，反向嵌合抗體即可      轉(zhuǎn)變?yōu)檫m宜藥用的全人源抗體。
人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的主要優(yōu)點是，其功效優(yōu)于其他生產(chǎn)抗正常人體蛋白 mAb 技術(shù)。小鼠識別抗原和動員抗該抗原的抗體系統(tǒng)仍保持完整，容易把人體蛋白識別為異物。轉(zhuǎn)基因小鼠的另一個優(yōu)點是，由于抗體是體內(nèi)產(chǎn)生，      經(jīng)歷正常裝配和成熟過程，從而保證成品具有較高的靶結(jié)合親和力。