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位置：分子互作資料 / LSPR技術(shù)

分子互作資料

LSPR技術(shù)

技術(shù)指南：COOH傳感器與胺偶聯(lián)試劑盒

1、概述
在COOH傳感器芯片表面上具有均勻的的羧基層。這些羧基能夠被標(biāo)準(zhǔn)EDC/NHS化學(xué)物激活并通過(guò)氨基化學(xué)偶聯(lián)配體（圖1）。Nicoya胺基偶聯(lián)試劑盒中包含所有完成該偶聯(lián)所需的試劑而且試劑盒已被優(yōu)化為最佳性能。這種耦聯(lián)方法使得配體穩(wěn)定的附著于表面，并且結(jié)合的相互作用可以很容易在OpenSPR儀器上測(cè)量。

LSPR技術(shù)1

共價(jià)偶聯(lián)

2、實(shí)驗(yàn)需要的試劑及儀器
● COOH傳感器芯片：儲(chǔ)存在2-8°C
● NHS：儲(chǔ)存在2-8°C，一旦稀釋分裝，儲(chǔ)存在–20°C
● EDC：儲(chǔ)存在2-8°C，一旦稀釋分裝，儲(chǔ)存在–20°C
● 激活緩沖液：儲(chǔ)存在2-8°C
● 封閉液：儲(chǔ)存在2-8°C
● 運(yùn)行緩沖液：1X PBS pH 7.4（需要老師配）
● 80%的IPA （異丙醇）（需要老師提供）
● 去離子水（需要老師提供）
● 瞬時(shí)離心機(jī)（需要老師提供）
● 移液槍及槍頭（1ml，200ul，100ul）（需要老師提供）
● 配體（固定到芯片）：蛋白純度高于90%，濃度（30-100ug/ml），體積大于200ul
● 分析物：蛋白或大分子濃度（30-100ug/ml），體積大于200ul，小分子（溶于DMSO的）要求濃度大于100uM 或30mg/ml
● 再生緩沖液100mM的HCL，或1%的SDS

EDC分裝準(zhǔn)備

1）將EDC溶解于1mL活化緩沖液中
2）用移液器分裝成10個(gè)100μL，儲(chǔ)存在–20°C.
NHS 分裝準(zhǔn)備
1）將NHS溶解于1mL活化緩沖液中
2）用移液器分裝成10個(gè)100μL，儲(chǔ)存在–20°C.
注：試劑必須從分裝瓶里現(xiàn)取現(xiàn)用，且在使用前混合。EDC / NHS酯的半衰期較短，因此配體激活后立刻上樣。此外，蛋白質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間在低pH值下通常不穩(wěn)定，所以配體稀釋到激活緩沖液后要立即注入。

LSPR技術(shù)2
再生緩沖液參考：

1. Acid 5-150 mM	2. SDS 0.01 – 0.5%
Proteins	Peptides
Antibodies	Proteins/Nucleic acids
3. NaoH 10 mM	4. IPA:HCl 1:1
Nucleic acids/Nucleic acids	■Lipids

緩沖條件
通常將大的配體如蛋白質(zhì)固定在COOH傳感器芯片上的方法預(yù)富集。預(yù)富集是利用靜電力在傳感器的表面增加配體的局部濃度的技術(shù)。Nicoya為預(yù)富集提供了優(yōu)化的激活緩沖液與胺偶聯(lián)試劑盒。不能被預(yù)富集的配體，需要通過(guò)其他方法固定，如通過(guò)組氨酸標(biāo)簽捕獲偶聯(lián)。
注意，緩沖液中胺組或強(qiáng)親核試劑如Tris或疊氮化鈉應(yīng)避免與胺基耦聯(lián)，因?yàn)檫@些基團(tuán)將與配體競(jìng)爭(zhēng)。
如果胺基耦聯(lián)試劑盒不能達(dá)到足夠的固定水平，可嘗試增加的配體的濃度。如果它仍然不夠，則需要進(jìn)一步優(yōu)化激活緩沖液。

3、COOH傳感器芯片實(shí)驗(yàn)步驟：

注–本程序假設(shè)儀器中使用的是100μL的樣品環(huán)。如果要安裝更大的樣品環(huán)，則需要重新調(diào)整體積。

1）按照標(biāo)準(zhǔn)程序，在OpenSPR儀器上安裝羧基傳感器芯片。
2）開始以最大流速運(yùn)行緩沖液（ex.1X PBS pH 7.4）。
3）在達(dá)到信號(hào)基線后，從上樣口注入80%的IPA，將控制閥轉(zhuǎn)到inject，運(yùn)行10s轉(zhuǎn)回到load進(jìn)行排氣泡，達(dá)到基線后，緩沖液沖洗樣本環(huán)，并用空氣排空。
4）注入10mM的Hcl 清洗芯片表面，運(yùn)行1min（芯片第一次用時(shí)需要此步驟）
5）減慢緩沖液流速至20μl/min。
6）解凍并立即混合1等分的EDC和NHS，注入到儀器中。與傳感器相互作用5分鐘。一旦相互作用結(jié)束，用緩沖液沖洗上樣口并用空氣排空。
7）用激活緩沖液稀釋用于固定的配體，體積為200μL濃度為10-50μg/mL。稀釋后立即將配體注入儀器（相互作用5分鐘）。在EDC / NHS完成抽吸后，這步需要快速連續(xù)的進(jìn)行。用緩沖液沖洗上樣口并用空氣排空。
單位換算：10ug/ml=10mg/L=[10mg/MW/mol)]/L=?mM/L = ?uM/L)
8）注入250μL封閉液（互相作用5分鐘）。一旦封閉液已經(jīng)通過(guò)，傳感器就可準(zhǔn)備用于測(cè)量分析物和配體之間的結(jié)合相互作用。沖洗和清除樣品回路。
9）通過(guò)比較EDC/NHS活化前與閉鎖后的信號(hào)，測(cè)量配體結(jié)合量。在圖2所示的示例中，它是約700pm。
10)如有已知的再生緩沖液條件，將泵的速度提高到150ul/min，注入再生緩沖液初始化配體表面。
11）將泵速調(diào)到20ul/min,注入高濃度的分析物以確認(rèn)配體的活性，并確認(rèn)表面的近似的最大結(jié)合能力。清洗及排空樣本環(huán)。
12）提高泵速到150μL/min，準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)脑偕彌_液和裝載250μL并注入以去除分析物。芯片表面即可用于分析物動(dòng)力學(xué)分析。
如下圖所示的例子。
LSPR技術(shù)2
圖2 COOH傳感器芯片配體的制備

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