在酒店他弄得我好爽_小浪货腿打开水真多真紧视频_成人免费大片黄在线观看com_麻花传媒MV在线播放高清MBA_国产系列一线二线三线区别_久久人妻一区二区三区_久久久精品久久日韩一区综合_99精品视频在线观看直播_极品少妇被猛的直喷白浆漫

哺乳動物細胞傳代培養(yǎng)

       隨著細胞基因工程的不斷發(fā)展，目前有多種生物表達系統(tǒng)都能夠大規(guī)模的生產重組蛋白，主要分為原核和真核兩類。      真核表達系統(tǒng)又包括：酵母表達系統(tǒng)，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)。相比之下，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)最突出的優(yōu)點是能夠促進蛋白的正確折疊和糖基化等翻譯后修飾，從而保證蛋白的天然活性，目前已成為表達和生產部分蛋白藥物、基因工程抗體等目的蛋白的首選宿主。
       哺乳動物蛋白表達常用的細胞有 HEK293（人胚腎細胞）和 CHO（中國倉鼠卵巢細胞）。這兩種細胞的應用最為廣泛，是在真核蛋白表達系統(tǒng)中最常用的細胞，具有以下特點：
1.具有準確的轉錄后修飾功能，表達蛋白在任何方面都最接近天然狀態(tài)；
2.具有重組基因的高效擴增和表達能力，外源蛋白整合穩(wěn)定；
3.具有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，表達水平較高；
4.CHO 屬于成纖維細胞，是一種非分泌細胞，自身很少分泌內源蛋白，有利于目的蛋白的分離純化；
5.HEK293 細胞具有更高的生長密度更快的生長速度，易培養(yǎng)，易轉染。
本文主要對 HEK293 細胞及 CHO 細胞傳代培養(yǎng)的基本原則、實驗步驟及注意事項進行介紹。

細胞培養(yǎng)基本原則

合適的細胞培養(yǎng)基
合適的細胞培養(yǎng)基是細胞傳代培養(yǎng)最重要的條件，培養(yǎng)基不僅提供給細胞在體外生長繁殖需要的基礎物質，還維持      細胞生長的整個環(huán)境，不同的細胞有不同的生長習性，因此要選擇合適的培養(yǎng)基。

優(yōu)質血清
目前，多數的合成細胞培養(yǎng)基都有添加血清，常用的血清有小牛血清、馬血清等。血清中含有細胞生長所必須的生      長因子，作為哺乳動物細胞培養(yǎng)的附加物，血清十分昂貴且存在多種問題，因此人們在不斷尋找可以替代血清的物      質。

無毒無菌的生長環(huán)境
體外生長的細胞缺乏對微生物和有毒物質的抵御能力，一旦被污染，會導致細胞死亡。因此在進行細胞傳代培養(yǎng)時，      無毒無菌的培養(yǎng)環(huán)境是必要條件。

溫度與氣體環(huán)境
細胞生長需要恒定的溫度，同時氣體（氧氣與二氧化碳）也是哺乳動物細胞培養(yǎng)的所必須的物質，HEK293 和 CHO 的細胞培養(yǎng)條件一般是 37℃，5%的二氧化碳環(huán)境。

細胞傳代實驗流程

細胞復蘇

1.提前將水浴鍋打開，預熱 37℃。
2.細胞培養(yǎng)基提前預熱，5-10ml 于 15ml 離心管中。
3.把凍存細胞立即投入 37℃水浴鍋中，輕微搖動，待融化后（大概 1-1.5min），取出。
4.用 75%乙醇消毒管外壁，放入超凈臺,轉移到含 5-10ml 培養(yǎng)基的 15ml 離心管中，離心 800-1000rpm，5min。
5.去掉上清，加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，轉移到培養(yǎng)皿中，前后左右輕輕搖動，使培養(yǎng)皿中的細胞分散均勻。
6.標記好細胞名稱，代數，日期，培養(yǎng)基等，放到 37℃的 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
7.貼壁細胞培養(yǎng)一般第二天就可以貼壁，根據細胞生長速度，2-3 天換一次培養(yǎng)基。
8.離心可能對某些細胞造成傷害，這些細胞可以不離心，只需要將 DMSO 的濃度降到 1%以下即可。（一般凍存液中 DMSO 濃度為 10%，即 1ml 凍存細胞需加 9ml 培養(yǎng)基。）

細胞傳代培養(yǎng)
1.當培養(yǎng)皿中的細胞覆蓋率達到 80%-90%時需要進行細胞傳代。
2.吸掉培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)液。
3.用 5ml PBS 洗滌細胞 1-2 次。
4.用 1ml 的 trypsin（胰酶）溶液，37℃作用數分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞呈圓形即將分離時，吸掉 trypsin 溶液。（若不去掉 trypsin 溶液，則在消化后加入適量（5:1）含血清培養(yǎng)基終止作用，離心后再去掉上清。）

5.輕拍培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶使細胞從瓶壁脫落，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，輕柔地吹打數次，使細胞分散均勻。再根據稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)瓶中，正常培養(yǎng)即可，剩余細胞懸液舍棄，放入收集瓶中。（細胞傳代時按 1：5 或更大比例稀釋）
6.trypsin 溶液中可以加入 0.02% EDTA 溶液，解離效果會更好，但消化后殘留在培養(yǎng)基中的 EDTA 會影響細胞的再次貼壁。

細胞凍存
1. 冷凍前確保細胞處于指數生長期，傳代后的 5mL 細胞懸液取出 1mL 接種到培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代。另取一無菌離心管，將剩余 4mL 細胞懸液置于其中，離心 1000rpm，5min（轉速勿超過 1500rpm）。
2. 離心后倒掉上層清液，收集下層細胞沉淀。向離心管中加入 900ul 完全培養(yǎng)基，用槍頭反復吹打重懸起細胞。取少量細胞懸液計數細胞濃度及凍前存活率。一般細胞濃度為 2~5×106cells/mL 較適宜。
3. 將細胞懸液轉入 1.5mL 無菌凍存管中，再加入 100ul 試劑級 DMSO，混勻，制成細胞凍存懸液（DMSO 最后濃度為 10％）。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數、日期，然后進行凍存。
4. 傳統(tǒng)方法：冷存管置于 4℃ 10 分鐘→-20℃ 30 分鐘→-80℃ 16~18 小時（隔夜）→液氮罐長期儲存（-20℃
勿超過 1 小時，防止胞內冰晶過大造成細胞死亡）。

細胞培養(yǎng)注意事項

• 細胞培養(yǎng)大瓶好于小瓶，細胞能夠充分汲取到養(yǎng)分且有利于細胞均勻分布

• 細胞培養(yǎng)基 DEME 為高糖培養(yǎng)基

• 保證細胞培養(yǎng)液新鮮，采用少量多次配置，或培養(yǎng)基保存于-20℃

• 控制胰蛋白酶消化時間，消化時間長，細胞貼壁效果差

• 控制好細胞傳代時間，細胞沒有完全鋪滿、細胞之間留有空隙時傳代最佳

• 細胞凍存和復蘇的原則是慢凍快復，最大程度的保證細胞復蘇成功率

研錦生物具有豐富的細胞培養(yǎng)經驗，熟悉各類細胞的培養(yǎng)方法：
 

瞬時轉染與穩(wěn)定轉染實驗原理的異同

瞬時轉染與穩(wěn)定轉染都是將目的基因轉染至特定哺乳動物細胞內，進而表達得到目的蛋白。不同的是瞬時轉染的方式外源基因并沒有轉染到細胞的染色體上而是存在于游離的載體上，這樣可以在短時間內獲得基因的表達產物，但是隨著細胞的不斷分裂增殖外源基因最終會丟失，無法繼續(xù)進行重組蛋白的生產；而利用細胞穩(wěn)定轉染則會將外源基因轉染至細胞染色體上，目的基因不會隨著細胞傳代而消失，穩(wěn)定轉染的細胞株能夠長期穩(wěn)定的生產目的蛋白。

圖 1：瞬時轉染與穩(wěn)定轉染原理對比

實驗操作的差別

1.瞬時轉染與穩(wěn)定轉染所用的質粒是不同的，瞬轉的質粒不需要帶有抗性，而用于穩(wěn)定轉染的質粒一定要帶有特定的抗性以便于后續(xù)的克隆株篩選。另外，兩者所用的培養(yǎng)基及實驗試劑也有所區(qū)別。

2.構建好質粒后，經過細胞復蘇、轉染、細胞培養(yǎng)、蛋白純化等步驟即可得到目的蛋白；而構建穩(wěn)定細胞系需要先將構建好的質粒線性化，再導入培養(yǎng)好的哺乳動物細胞內，通過一定的轉染方式實現(xiàn)質粒與細胞的融合，接著經過細胞池篩選、單克隆篩選、細胞傳代培養(yǎng)等步驟才能得到穩(wěn)定轉染的細胞系。對穩(wěn)定細胞系進行培養(yǎng)能夠長期穩(wěn)定的生產目的蛋白。

圖 2：瞬時轉染實驗流程                                          圖 3：細胞穩(wěn)定轉染實驗流程

瞬時轉染與穩(wěn)定轉染優(yōu)缺點對比