真核表達是近年來常用的一種表達重組蛋白的手段,它補充了一些原核蛋白表達系統(tǒng)中所缺乏的功能,例如真核表 達時能夠形成穩(wěn)定的二硫鍵,在蛋白經(jīng)過翻譯后可對蛋白進行正確修飾,使表達出來的蛋白更具天然活性而不是被降解或者是形成包涵體;利用真核表達系統(tǒng)可以誘導高效表達,加快了人們對基因研究以及藥物研究的進程。
真核表達系統(tǒng)與原核表達系統(tǒng)的區(qū)別
表達系統(tǒng) |
類別 |
優(yōu)缺點 |
表達方式 |
優(yōu)缺點 |
系統(tǒng)應用與比較 |
真核表達系統(tǒng) |
哺乳動物細胞系統(tǒng) | 能誘導高效表達,對表達的蛋白進行正確折疊,并進行復雜糖基化修飾,蛋白活性接近于天然蛋白,不需去除內(nèi)毒素,周期較長,操作復雜,需要細胞房,無菌,成本投入高 |
瞬時轉(zhuǎn)染 | 能夠快速靈活的制備活性蛋白,周期為 3-4 天;外源基因不能整合到細胞上,不能穩(wěn)定表達目的蛋白,不適合大批量表達蛋白 |
哺乳動物系統(tǒng)是基因工程藥物的生產(chǎn)平臺,適用于新基因的發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究。是真核表達系統(tǒng)中成本最昂貴的但是也是唯一可以表達復雜蛋白基因的系統(tǒng) |
穩(wěn)定細胞系構(gòu)建 | 外源基因能在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達,篩選出的穩(wěn)定細胞株能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白的大量生產(chǎn)篩選困難且時間長,投入大 | ||||
酵母表達系統(tǒng) |
遺傳背景清楚,操作較為簡便,容易進行遺傳操作,有較為完善的真核蛋白表達控制系統(tǒng) |
畢赤酵母表達 | 能大規(guī)模真核表達蛋白,可表達出克級蛋白;甲醇誘導操作方面需要時間;甲醇毒性大,不適用于生產(chǎn)食品蛋白 |
在基因,遺傳疾病研究中運用廣泛,許多遺傳性疾病的基因都和酵母基因有很高的同源性,研究酵母基因的編碼以及其真核蛋白表達的蛋白可加深對這些疾病的了解,與哺乳動物系統(tǒng)相比只能表達簡單修飾的蛋白 | |
釀酒酵母表達 | 機理清楚,遺傳操作簡單; 沒有特異型病毒,成本低; 可能會超糖基化;產(chǎn)生乙醇對細胞具有毒性 | ||||
昆蟲 表達系統(tǒng) | 細胞表達量高;表達的外源基因片段很大,最大可達到 200KD; 可實現(xiàn)蛋白的糖基化和磷酸化修飾;投入成本較高 | 昆蟲系統(tǒng)適用于表達高等真核生物蛋白 可大規(guī)模懸浮培養(yǎng),基礎(chǔ)研究,醫(yī)藥衛(wèi)生以及農(nóng)業(yè)。成本較酵母系統(tǒng)較貴,但比哺乳系統(tǒng)便宜 | |||
原核表達系統(tǒng) | 大腸 | 基因表達產(chǎn)物時間短,操作簡單,背景簡單清楚,適用范圍廣; 表達出來的蛋白可能會以包涵體形式存在,不利于蛋白純化; 不能對目的蛋白進行糖基化修飾,表達出來的蛋白需要內(nèi)毒素去除 | 表達的蛋白常用于制備抗體, 用于對蛋白活性沒有要求的蛋白表達;抗體疫苗的研究 |
真核表達系統(tǒng)的選擇與應用
酵母蛋白表達系統(tǒng)
酵母真核蛋白表達系統(tǒng)有甲醇酵母表達系統(tǒng),釀酒酵母表達系統(tǒng),裂殖酵母表達系統(tǒng)以及克魯維酸酵母表達系統(tǒng)等,其中最早應用于基因工程的酵母是釀酒酵母,但現(xiàn)在運用最廣泛的酵母表達系統(tǒng)還是甲醇酵母表達系統(tǒng)中的畢赤酵母真核蛋白表達系統(tǒng)。
哺乳動物細胞表達系統(tǒng)
哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是真核表達系統(tǒng)中唯一可以表達復雜蛋白的系統(tǒng),它能夠指導真核表達蛋白進行正確折疊,提供復雜的 N 型糖基化和準確的 O 型糖基化等多種翻譯后加工功能,所以它和昆蟲酵母系統(tǒng)比較更具有發(fā)展?jié)摿Γ?哺乳動物細胞真核表達的蛋白與天然真核表達蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白, 但成本較高也一定程度上減緩了它的發(fā)展速度。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)主要是通過改造宿主細胞來提高外源蛋白的表達效率,常用的宿主細胞有 CHO、COS、BHK、SP2 /0N 等,哺乳動物轉(zhuǎn)染方法*有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,電穿孔法以及病毒轉(zhuǎn)染等。