細(xì)胞株是通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)細(xì)胞。從培養(yǎng)代數(shù)來(lái)講，可培養(yǎng)到40-50代。且細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。對(duì)于人類(lèi)腫瘤細(xì)胞，在體外培養(yǎng)半年以上，生長(zhǎng)穩(wěn)定，并連續(xù)傳代的即可稱(chēng)為連續(xù)性株或系。

將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選，篩選來(lái)得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，或者穩(wěn)定表達(dá)沉默特定基因的細(xì)胞株。

最常用的真核表達(dá)載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)。

多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株的熒光通常強(qiáng)弱夾雜，從感染72小時(shí)后開(kāi)始加入篩選藥物，每隔2天重新?lián)Q液加入篩選藥物。藥物篩選需至少持續(xù)14天，直至顯微鏡下觀察到的熒光細(xì)胞比例為100%。

穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株主要應(yīng)用于以下研究中：

1、需要長(zhǎng)期在目的細(xì)胞中研究基因功能。通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也方便長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究；

2、部分蛋白半衰期及長(zhǎng)，瞬時(shí)RNA只能干擾表達(dá)，無(wú)法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定株可以實(shí)驗(yàn)更好的基因干擾效果；

3、瞬轉(zhuǎn)會(huì)引入不可預(yù)期的拷貝數(shù)表達(dá)（往往瞬時(shí)表達(dá)較高），導(dǎo)致因?yàn)槿藶橐蛩卦斐蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果的不精確，構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選到拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；

4、穩(wěn)轉(zhuǎn)株可以用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)，用于控制基因的時(shí)空表達(dá)；

5、需要用目的細(xì)胞構(gòu)建動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)，往往需要構(gòu)建成穩(wěn)定株。

慢病毒幾乎可以感染所有種類(lèi)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)，因此，慢病毒常用于制備穩(wěn)定表達(dá)/沉默特定基因的單克隆細(xì)胞株。

如何用慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株：

1、目的細(xì)胞的合適抗生素濃度篩選；

2、目的細(xì)胞的合適病毒滴度篩選；

3、慢病毒構(gòu)建與包裝與滴度測(cè)定；

4、慢病毒感染；

5、特定抗生素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；

6、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株鑒定。

穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建是一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間多平臺(tái)合作的項(xiàng)目，有多種因素容易導(dǎo)致穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建失敗，你都遇到過(guò)哪些情況呢？