等溫滴定量熱法用來測定各生物分子之間的反應(yīng)。該方法可測定結(jié)合親和力、化學(xué)計(jì)量以及溶液中結(jié)合反應(yīng)的熵和焓，無需使用標(biāo)記。發(fā)生結(jié)合時(shí)，熱不是被吸收就是被釋放，這是在配體被逐漸滴定到包含目標(biāo)生物分子的樣品池過程中通過靈敏量熱計(jì)而測得。

圖為原理示意

進(jìn)行測量

參比池和樣品池被設(shè)定到所需的實(shí)驗(yàn)溫度。將配體裝入一個(gè)非常精確的注射裝置上的注射器中。將注射裝置插入包含目標(biāo)蛋白質(zhì)的樣品池中。將一系列小份配體試樣注入到蛋白質(zhì)溶液中。如果有配體與蛋白質(zhì)結(jié)合，則可檢測到并測出幾百萬分之一攝氏度的熱量變化。進(jìn)行第一次注射時(shí)，微量熱計(jì)測量被釋放的所有熱量，直到結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡。  測得的熱量與結(jié)合量成正比。

結(jié)果和數(shù)據(jù)分析

在下面的示例中，反應(yīng)是放熱的，這就意味著樣品池溫度高于參比池并由此導(dǎo)致信號(hào)出現(xiàn)下行波峰。隨著兩個(gè)池的溫度恢復(fù)到同一水平，信號(hào)也回到其起點(diǎn)。將第二小份配體試樣注入到樣品池中，同樣，微量熱計(jì)補(bǔ)償所檢測到小幅熱量變化。配體與蛋白質(zhì)之間的摩爾比隨著一系列配體試樣的注入而逐漸增加。蛋白質(zhì)越來越飽和，配體結(jié)合的次數(shù)越來越少，并且熱量變化開始減小，直到樣品池中的配體數(shù)量相對于蛋白質(zhì)而言最終表現(xiàn)出過量為止，從而使反應(yīng)朝飽和的方向進(jìn)行。

圖為原理示意

然后對每個(gè)峰的面積進(jìn)行積分，并以配體與蛋白質(zhì)的摩爾比作為橫坐標(biāo)進(jìn)行繪圖。由此得出的等溫線可擬合至導(dǎo)出親和力 (KD) 的結(jié)合模型。結(jié)合等溫線中心的摩爾比即為反應(yīng)化學(xué)計(jì)量。下圖給出了 1:1 結(jié)合反應(yīng)的示例圖。

焓 (ΔH) 也可通過等溫線直接導(dǎo)出，它表示每摩爾結(jié)合配體所釋放的熱量。這就意味著一次 ITC 實(shí)驗(yàn)就可提供豐富的結(jié)合反應(yīng)信息，有助于理解相互作用的性質(zhì)并探索熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)因素。

ITC 廣泛用于藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領(lǐng)域的以下方面：

量化結(jié)合親和力

候選藥物的選擇與優(yōu)化

測定熱力學(xué)特性和活性濃度

作用機(jī)制表征

在小分子藥物發(fā)現(xiàn)過程中確認(rèn)預(yù)期結(jié)合靶標(biāo)

測定結(jié)合特異性和化學(xué)計(jì)量

驗(yàn)證從苗頭化合物到先導(dǎo)化合物演化過程中的 IC50 值和 EC50 值

酶動(dòng)力學(xué)測定